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检测原理：

碱性条件下蛋白将 Cu²⁺还原为 Cu⁺，Cu⁺与 BCA 螯合生成紫色复合物，测定其在 562nm 处的吸收值， 并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

常用浓度的去垢剂 SDS，Triton X-100，Tween 不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA, EGTA)、还原剂 （DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。

注意事项

1. BCA 工作液必须现配，放置超过 24 h 显色能力下降；

2. 移液精准，低浓度标准点误差大，样品尽量落在 0.1–0.4 mg/mL 区间；

3. 孵育温度越高，颜色越深，全程温度统一，避免孔间温差；

4. 颜色随时间持续加深，孵育后尽快测读，不要放置过夜；

5. 浑浊样品需离心取上清再定量，避免颗粒干扰 OD；

6. 若样品浓度＞0.5 mg/mL，必须梯度稀释，超出线性范围结果失真；

7. 透明平底 96 孔板专用，白板/黑板无法测 562 nm 吸光值。

使用说明：

1.  取适量蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS 稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20ºC长期保存。

2. BCA工作液配制 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100µl BCA 试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

3. 蛋白浓度测定

a. 将标准品按0、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20µl，相当于标准品浓度分别为 0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20µl，需加标准品稀释液补足到20µl。请注意记录样品体积。

c. 各孔加入200µl BCA工作液，37ºC放置20-30分钟。

d. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。

e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。